Prof. Dr. med. Simon Lebek

In der vorliegenden Arbeit haben wir mehrere CRISPR-Cas9-Geneditingstrategien entwickelt, um die CaMKIIδ resistent gegenüber einer oxidativen Überaktivierung zu machen. Durch Adenin-Basenediting wandelten wir ATG- in GTG-Codons um, welche von der Zelle nunmehr als Valine anstatt als Methionine gelesen werden. Nach intensiven Optimierungsschritten charakterisierten wir die zwei vielversprechendsten Editingstrategien an humanen Kardiomyozyten, die aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSCs) differenziert wurden. Mithilfe einer Hypoxiekammer simulierten wir den Ischämie-/Reperfusionsschaden (IR) in vitro. Stimulierte Kalzium-Transienten (Epifluoreszenzmikroskopie) dienten als Maß für die myokardiale Funktion. Bereits unter Kontrollbedingungen zeigten sich geringere diastolische Kalzium-Spiegel, was möglicherweise die diastolische Funktion verbessert. Während Wildtyp-Kardiomyozyten nach IR eine verringerte Kalzium-Transientenamplitude, eine erhöhte diastolische Kalzium-Überladung und Arrhythmien aufwiesen, waren CaMKIIδ-editierte Kardiomyozyten davor geschützt.

Die Editingstrategie, welche in vitro am meisten überzeugte, wurde genutzt, um adulte Wildtyp-Mäuse nach einem künstlich herbeigeführten Herzinfarkt (IR, 45 min Ischämie mit anschließender Reperfusion) zu behandeln. Unter Verwendung eines Adeno-assoziierten Virus des Serotyps 9 (AAV9) injizierten wir die CaMKIIδ-editierenden Komponenten direkt nach der Reperfusion in das Infarktareal. Bemerkenswerterweise erholte sich die Herzfunktion von CaMKIIδ-editierten Mäusen und erreichte fast das Niveau von Sham-Kontrolltieren (Echokardiographie und kardiale Magnetresonanztomographie). Da CRISPR-Cas9-Genediting eine permanente Lösung darstellt, war eine einmalige Behandlung am Tag des Herzinfarkts ausreichend.

Die RNA-Sequenzierung ergab bei Kontrollmäusen nach IR, nicht jedoch bei CaMKIIδ-editierten Mäusen, eine charakteristische Dysregulation des kardialen Transkriptoms, welches typisch für kardiale Pathologien war. Wie erwartet zeigten Kontrollmäuse nach IR vermehrt Apoptose und Fibrose (TUNEL und Histologie), welches durch Editing der CaMKIIδ deutlich abgemildert werden konnte.

Mithilfe eines kardialen Troponin-T-Promotors erzielten wir eine herzspezifische Expression der Genediting-Komponenten. So zeigte sich ausschließlich Editing im Herzen, nicht jedoch im Gehirn, im Musculus tibialis anterior oder in der Leber, was das Risiko potenzieller Nebenwirkungen minimiert.